ГЕННА ТЕРАПІЯ: ДОСЯГНЕННЯ, ПЕРСПЕКТИВИ

 

Микола Великий

доктор біологічних наук, професор, академік АН ВШ

завідувач лабораторії медичної біохімії

Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України

veliky@biochem.kiev.ua

 

Генетичний матеріал (геном) кожної соматичної клітини організму людини розподілений у 46 хромосомах та включає близько 20000 генів. Оскільки нормальне функціонування організму забезпечується одночасною роботою значної кількості взаємопов’язаних генів, мутації навіть в одному з них можуть обумовлювати самі різні наслідки. Так, мутація, внаслідок якої змінюється активність певного ензиму, може приводити до накопичення токсичного субстрату або дефіциту сполуки, необхідної для нормального функціонування клітини. Мутація в гені, що кодує структурний протеїн, призведе до серйозних порушень на рівні клітин, тканин та органів.

Зміна концентрації та активності будь якого ензиму в клітинах (тканинах) викликає порушення протікання відповідної ензиматичної реакції. Такі порушення ензиматичних процесів є біохімічною основою розвитку патологічних процесів. У випадку, коли зменшення кількості ензиму у певному метаболічному шляху виникає внаслідок природженої нездатності клітини до його біосинтезу і є результатом дії спадкових, генетичних факторів – виникають молекулярні хвороби, що проявляються як уроджені вади метаболізму. Їх молекулярною основою є генетично детерміновані дефекти ензимів – ензимопатії, спричинені мутаціями в складі генів, які відповідають за синтез певних ензимів-протеїнів. Поняття “уроджені вади метаболізму” було введене в 1908 році лікарем A.Garrod, який першим розпізнав спадкову природу таких порушень метаболізму в людини як алкаптонурія, цистинурія, альбінізм та пентозурія. З понад 10 тисяч відомих на сьогодні хвороб людини, близько 3,5 тисяч є спадковими, тобто генетично детермінованими.

Наслідки генетичних дефектів протеїнів-ензимів для організму залежать від міри інгібування ензиму (рівня залишкової активності); ролі заблокованого метаболічного шляху в обміні речовин; наявності альтернативних (обхідних) шляхів; ступеня токсичності метаболітів, які накопичуються внаслідок блокади метаболічного шляху, тощо. Ензимопатії, що супроводжуються повною втратою активності ензиму (внаслідок генетичного блоку синтезу ензиму) проявляються як важкі, часто несумісні з життям захворювання. Наприклад повний генетичний блок синтезу ензимів урогенезу можливий лише у плода за рахунок того, що детоксикація аміаку здійснюється організмом матері. Часткова втрата активності ензиму і нагромадження проміжних продуктів обміну веде до розвитку характерного захворювання. Незначна втрата активності ензиму проявляється у зниженні адаптивних властивостей організму і служить причиною схильності до певного захворювання.

Наприклад, мутація в гені ензиму печінки – фенілаланін-гідроксилази, внаслідок якої блокується шлях метаболізму ароматичних амінокислот, а саме, перетворення фенілаланіну в тирозин, проявляється у вигляді серйозних порушень нервової системи. У гомозиготного за цим дефектним геном індивідууму, ензим або взагалі не продукується, або ж утворюється в незначній кількості, що веде до підвищення рівня ендогенного фенілаланіну та продукту його неензиматичного перетворення – фенілпірувату (фенілкетону) в крові, неправильному формуванню мієлінової оболонки навколо аксонів нервових клітин центральної нервової системи і, як наслідок – до важкої розумової відсталості (фенілпіровиноградної олігофренії). Це уроджене захворювання, що носить назву фенілкетонурія, зустрічається в Європі з частотою 1 на 10000 новонароджених, а в Україні – 1 на 7000 новонароджених. Дві інші мутації в генах оксидази гомогентизинової кислоти та тирозинази – ензимів цього ж  метаболічного шляху проявляються як алкаптонурія та альбінізм, захворювання, що не мають таких фатальних наслідків для організму.   

Поряд з мутаціями, що супроводжуються втратою функції ензиму-протеїну, виявлено ряд мутацій, що посилюють активність ензимів, або ж протеїн набуває нової функції. Набута функція може проявлятись у зміні субстратної специфічності, необоротній активації сигнального протеїну або іонного каналу, аномальній олігомеризації протеїну або синтезі химерного протеїну. Прикладом набутої функції може служити місенс-мутація Ala366-Ser в гені, що кодує синтез α-субодиниці гетеротримерного GTP-зв’язувального GS протеїну. Цей протеїн передає сигнал зв’язування ліганда з β-адренергічним рецептором на аденілатциклазу у клітинній трансдукції гормонального сигналу. Внаслідок мутації змінюються GTP-зв’язувальні властивості протеїну і він стає термолабільним при 37оС. Висока термолабільність GS протеїну веде до значного зниження його активності в тканинах та  розвитку спадкової остеодистрофії Олбрайта.

Метою медико-генетичних досліджень є виявлення мутацій в складі генів,  діагностування обумовлених ними спадкових захворювань та створення високоефективних методів лікування. Діагностування генетичних порушень проводиться за допомогою методів молекулярної діагностики, провідним серед яких є ДНК-аналіз. За метою, що ставиться при проведенні молекулярної діагностики розрізняють наступні її види: дошлюбна діагностика генетичних порушень; преконцепційна діагностика при плануванні народження дитини; передімплантаційна діагностика при     штучному заплідненні; пренатальна (дородова) діагностика генетичних порушень; неонатальний скринінг у новонароджених. Пренатальна (дородова) діагностика проводиться шляхом ДНК-аналізу відібраних клітин амніотичної рідини на 16 тиждень вагітності або  клітин ворсинок хоріону отриманих біопсією на 10-12 тиждень вагітності. Після виявлення дефектного гена, що обумовлює розвиток спадкового захворювання, настає черга наступного етапу, а саме виправлення функції дефектного гена за допомогою підходів генної терапії.

Генна терапія – сукупність генно-інженерних (біотехнологічних) та медичних методів, що направлені на внесення змін у генетичний апарат соматичних,  статевих або ембріональних клітин людини з метою лікування спадкових та набутих захворювань. “Ремонт генів” має фундаментальну перевагу в порівнянні з іншими методами лікування, оскільки дає можливість корегувати дефекти на первинному молекулярному рівні. Йдеться про генну терапію соматичних клітин, оскільки робота з статевими клітинами та клітинами плода заборонена як з етичних міркувань, так і законодавчо.

Генна терапія соматичних клітин людини – корекція специфічного спадкового захворювання шляхом введення в дефектну соматичну клітину-мішень функціонального гена, здатного до експресії. Перспективи генної корекції соматичних клітин стали реальними у 80-х роках минулого сторіччя. На той час були розроблені методи отримання ізольованих генів, створені еукаріотичні експресуючі вектори, стали рутинними експерименти з переносу генів на мишах та інших піддослідних тваринах. Після того як були встановлені молекулярні основи трансформації бактерій (перенесення генів з одного штаму в інший), з’явилась надія, що аналогічний механізм – введення нормальних генів в дефектні соматичні клітини – можна буде використати для лікування спадкових захворювань людини.

Неконтрольоване зниження чи підвищення концентрації будь якого ензиму в клітинах (тканинах) викликає порушення протікання відповідної ензиматичної реакції, є біохімічною основою розвитку патологічного процесу і для його лікування застосовують один з наступних видів генної терапії. 

Замісна терапія – використовується для лікування генетичних дефектів, обумовлених втратою функції гена. Суть полягає у введенні у клітини копії нормального “терапевтичного” гена та створення умов його замісної експресії, щоб замінити функцію дефектного гена.

Інгібіторна терапія лікування генетичних захворювань, обумовлених  надмірною активацією гена. Стратегія скерована на вбудовування гена, продукт якого блокує експресію патологічного гена і тим самим гальмує розвиток хвороби.

Елімінація певних клітин знищення конкретної популяції клітин, зокрема трансформованих. Стратегія може включати: утворення в клітині токсичного продукту; експресію ензиму, що перетворює нетоксичний лікарський препарат в токсичний продукт; специфічне мічення клітин для їх елімінації імунною системою. Значні успіхи досягнуті в посиленні експресії цитохрому Р-450 в трансформованих (ракових) клітинах. Перетворення нетоксичних сполук за дії цього ензиму на високотоксичні вбиває саме ракові клітини.

Застосування підходів генної терапії з метою введення у клітини-мішені функціонального гена вимагає вирішення ряду проблем, зокрема як отримати доступ до клітин, що повинні піддаватись корекції; як здійснити доставку терапевтичного гена; яка доля клітин-мішеней повинна отримати ген, щоб загальмувати розвиток хвороби; чи контроль транскрипції гена є достатнім для забезпечення ефективності його функціонування; чи не викличе надлишкова експресія введеного гена побічних ефектів; чи будуть модифіковані клітини функціонувати (підтримуватись) безмежно довгий час, чи необхідно буде проводити повторні введення? На ряд поставлених запитань, які стосуються певних спадкових захворювань, вже отримано відповіді.

Підходи, що застосовуються в генній терапії можна розділити на дві суттєво відмінні категорії, відомі як генна терапія ex vivo та генна терапія in vivo.

Генна терапія ex vivo, тобто зовнішня, включення “терапевтичного”  гена в геном клітин здійснюється поза організмом. Клітини крові, кісткового мозку або інших тканин отримують від пацієнта, трансформують (вбудовують необхідний “терапевтичний” ген) поза організмом, здійснюють відбір та нарощування “виправлених” клітин і потім повертають модифіковані клітини в організм пацієнту шляхом інфузії або трансплантації. Використання власних (аутологічних) клітин пацієнта гарантує, що після інфузії чи трансплантації у нього не буде розвиватись імунна відповідь.

Особливо перспективним напрямом у генній терапії ex vivo виявилась генно-інженерна модифікація поліпотентних стовбурових клітин кісткового мозку з їх наступною інфузією або трансплантацією пацієнту. Терапевтичний ефект трансплантації кісткового мозку пов’язаний з наявністю в ньому  ембріональних стовбурових клітин, які здатні проліферувати і диференціюватись в різні типи клітин крові, зокрема такі як В- та Т-лімфоцити (В- та Т-клітини), макрофаги, еритроцити, тромбоцити та остеобласти. Наприклад, у випадку якщо генна мутація порушує функції макрофагів, трансплантація кісткового мозку забезпечує реципієнту постійний запас компетентних макрофагів, які утворюються з поліпотентних стовбурових клітин.

Значних успіхів було досягнуто у лікуванні генетичного дефекту ензиму аденозиндезамінази (АДА), який викликає порушення метаболізму пуринів та  призводить до підвищення в крові рівня аденозину та дезокси-аденозину. Їх токсична дія веде до загибелі В- та Т-лімфоцитів та розвитку важкого комбінованого імунодефіциту (SCIDsevere combined immunodeficiency). Оскільки В- та Т-лімфоцити утворюються зі  стовбурових клітин, то перенесення в стовбурові клітини “нормального” гена АДА з наступним введенням їх пацієнту, сприяє зниженню в його крові рівня аденозину та дезоксиаденозину, що попереджує руйнування В- та Т-лімфоцитів

В 1990 р. було здійснено перше успішне застосування генної терапії для лікування SCID у двох дівчаток. Ця робота продемонструвала безпечність генної терапії ex vivo з використанням стовбурових клітин кісткового мозку. В теперішній час для лікування SCID у новонароджених переважно використовують стовбурові клітини пуповинної (кордової) крові. З пуповинної крові отримують стовбурові (CD34) клітини, трансдукують в них кДНК ензиму АДА і такі генетично модифіковані клітини вводять новонародженим з дефіцитом АДА та симптомами SCID. Показана висока ефективність такого лікування саме у новонароджених.

Прикладом успішної генної терапії ex vivo з використанням аутологічних клітин, є випадок з пацієнткою гомозиготною по рецесивному гену сімейної гіперхолестеринемії. Її гепатоцити були позбавлені рецепторів ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ), не поглинали ЛПНЩ та не вивільняли холестерол для потреб клітин. Постійна циркуляція в крові великої кількості холестеролу викликала закупорку артерій та важку хворобу серця. Застосовувані лікарські засоби були неефективними, а шунтування коронарних артерій давало короткочасний ефект. У пацієнтки відібрали біля 15% печінки, гепатоцити помістили в культуральне середовище і ввели в них ДНК рекомбінантного ретровірусу, що містив кДНК протеїну ЛПНЩ- рецептора. Затим здійснили інфузію трансдукованих гепатоцитів в печінку пацієнтки, де вони прижились, експресували кДНК ЛПНЩ- рецептора та виробляли функціонально активний протеїн-рецептор, як мінімум 20 місяців. Стан пацієнтки за показниками вмісту ліпідів значно покращився. Важливо, що в її організмі не утворювались антитіла до протеїнів ЛПНЩ- рецепторів.

Генна терапія in vivo передбачає доставку “терапевтичного” гена безпосередньо в клітини певної тканини пацієнта. З цією метою клонується терапевтичний ген, що кодує синтез протеїну, який корегує генетичний дефект. Клонований ген доставляється до клітин певної тканини пацієнта зі спадковим захворюванням і в них експресується. Оскільки генетична конструкція вводиться в організм і досягає всіх клітин, важливо щоб промотор p, під контролем якого здійснюється транскрипція, мав високу тканинну специфічність і забезпечував експресію ”терапевтичного” гена лише в певній тканині.

Надзвичайно важливою проблемою генної терапії є вибір способу доставки терапевтичного гена до тканини-мішені. Ідеальна система доставки “терапевтичного” гена повинна забезпечувати: високу ефективність цільового поглинання “терапевтичного” гена клітинами-мішенями; мінімальне його внутрішньоклітинне руйнування під час транспорту в ядро; високий рівень експресії, який забезпечить лікувальний ефект; відсутність перебудов і мутацій; відсутність імуногенності продукту експресії.

Вірусні системи доставки „терапевтичних” генів. Серед способів введення генних конструкцій в організм лідирують вірусні вектори, які швидко поширюються в організмі та проникають у клітини подібно до своїх вірусів-пращурів. Найбільш ефективними для цілеспрямованої доставки “терапевтичного” гена в геном клітини-мішені  та його експресії виявились вектори, створені на основі мишачих ретровірусів. Була розроблена процедура створення  ретровірусного вектора. Для отримання вектора проводять наступні операції: повнорозмірну ДНК ретровіруса вбудовують в плазміду; за допомогою ендонуклеазного розщеплення видаляють більшу частину гена gag і гени pol та env, залишаючи 5'- кінцевий залишок гена gag та    5'- і 3'- LTR; поряд  з  ψ+- ділянкою вбудовують “терапевтичний” ген, транскрипція якого буде контролюватись 5'-LTR - промотором; вбудовують і маркерний селективний ген з власним промотором. Отримана конструкція включає терапевтичний та маркерний гени і дозволяє експресувати обидва клоновані гени. Максимальний розмір ДНК-вставки, яку може переносити ретровірусний вектор, складає 8 т.п.н. Однак ефективність її доставки в ядро і подальшої інтеграції в геном клітини-господаря є дуже низькою.

В подальшому була розроблена методика упаковки повнорозмірної РНК вірусного вектора в інтактні вірусні частки за допомогою „пакувальної” та „продукуючої” клітинних ліній. Така упаковка забезпечує високу ефективність проникнення вірусних часток в клітину та гарантує вбудовування відповідної до неї ДНК в геном клітини-господаря. Для цього методами генної інженерії була створена “пакувальна” клітинна лінія, яка містила в одній з ділянок геному Δψ+-сегмент  5'-LTR-gag-3'-LTR (тобто сегмент, позбавлений повної функціональної ψ+-послідовності), а в іншій ділянці – Δψ+-сегмент  5'-LTR-pol-env-3'-LTR. Обидва ці сегменти здатні транскрибуватись, однак із-за відсутності повної ψ+-послідовності утворюються молекули вірусної РНК меншого ніж в нормі розміру, а тому формуються пусті вірусні частки. При трансфекції ДНК ретровірусного вектора в такі клітини, ДНК ретровіруса встроюється в хромосомну ДНК клітин і транскрибується з утворенням повнорозмірної РНК ретровіруса, що містить ψ+-послідовність. За таких умов у вірусні капсиди упаковується лише РНК вектора. Утворені інтактні вірусні частки можна використовувати для високоефективної доставки ретровірусного вектора в клітини-мішені. В “пакувальній” клітинній лінії нуклеотидні послідовності ретровіруса та вектора локалізовані в трьох різних ділянках хромосоми, а тому мало вірогідною є така послідовність рекомбінацій, яка приведе до утворення компетентного по реплікації ретровіруса.

Ретровіруси активно інфікують клітини, що реплікуються. Для перенесення генів в клітини-мішені, що інтенсивно ростуть, їх обробляють очищеними частками упакованого ретровірусного вектора, або ж проводять їх спільне культивування з клітинною лінією, яка продукує вектор. Далі здійснюють вибіркову селекцію для розділення клітин-мішеней та “пакувальних” клітин. Після тестування трансдуковані клітини нарощують у великих кількостях та з різними інтервалами вводять пацієнту. Суттєвим недоліком застосування ретровірусів є їх здатність викликати злоякісну трансформацію клітин. Необхідно зменшити або повністю виключити таку можливість.

Для створення векторів використовуються різні віруси, зокрема у 27% випадків використовуються ретровіруси, у 26% – аденовіруси, у 15% – гола плазмідна ДНК, у 16% – аденоасоційовані віруси, у 10% – вірус простого герпесу, у 4% – лентивіруси, вірус папіломи, гібридні вірусні конструкції, в тому числі на базі вірусу простого герпесу й аденоасоційованого вірусу, тощо. Проблемою в генній терапії in vivo є також те, що ретровірусні вектори проникають лише в клітини-мішені які діляться, тоді як в багатьох тканинах на які спрямована генна терапія, більшість клітин не діляться. Тому були розроблені різні вірусні та невірусні векторні системи доставки “терапевтичних” генів, виходячи з широкого спектру потенційних тканин-мішеней (шкіра, м’язи, мозок, товста кишка, селезінка, печінка, клітини крові, тощо) та розподілу їх в організмі людини.

Невірусні системи доставки терапевтичних генів в клітини у генній терапії.  Невірусні системи доставки включають фізичні та хімічні методи. До фізичних  методів належать: мікроін’єкції, ін’єкція струменем, електропорація, заморожування-відтаювання, біобалістика (бомбардування клітин краплями рідини або суспензією часточок золота з адсорбованою плазмідою).  Хімічні методи ґрунтуються на використанні солей деяких катіонів (наприклад кальцію), ДЕАЕ-декстрану, полілізину, ліпосом, тощо.

Пряме введення ДНК-конструкції в клітини-мішені шляхом ін’єкції є  самим простим методом доставки трансгена (гена, що переноситься) в клітини in vivo, за якого ДНК вводиться безпосередньо в тканину шляхом ін’єкції. Область застосування даного методу обмежується такими тканинами як шкіра, тимус, поперечно-смугасті мязи, деякі солідні (ті, що ростуть щільним вузлом) пухлини. Крім того, для здійснення прямого введення потрібні великі кількості ДНК. Досить тривала (до року) експресія трансгена спостерігається переважно в мязовій тканині. Ефективність такого способу трансфекції зазвичай низька (складає менше 1%), але достатня наприклад для генетичної імунізації. Існують методи прямого внесення генів у тканини через кровоносні судини, що проходять крізь орган, який необхідно трансфікувати (зокрема при лікуванні хвороб печінки), методи прямої ін’єкції у ниркову паренхіму та у тканину сечовивідних шляхів. Аерозольне введення генетичного матеріалу в клітини дихальних шляхів використовується при лікуванні захворювань легень.

Біолістична трансфекція грунтується на обстрілюванні (бомбардуванні) органів і тканин мікрочастками важких металів (золото, вольфрам діаметром 1-3 мкм) покритих плазмідною ДНК. Введені таким чином “терапевтичні”  гени експресуються в клітинах-мішенях, а їхні продукти потрапляють у кров. В якості засобів використовуються схожі на стрілецьку зброю біолістична “генна”  гармата, біолістична рушниця, гелієвий пістолет. Мікрочастинки проходять через клітинні шари і переносять генетичну конструкцію безпосередньо у ядра клітин. Глибина проникнення мікрочасток, як правило, невелика – до 1 мм, тому метод використовується переважно для трансфекції шкіри або прилеглої хрящової тканини. Особливі умови обстрілу дозволяють мікрочастинкам проникати на глибину до 4-5 мм і переносити генні конструкти у волокна поперечно-смугастих м’язів.  

Перспективним способом прямого введення ДНК-конструкції в клітини-мішені є доставка генетичної конструкції в ліпосомах. Зокрема в катіонних ліпосомах з позитивним зарядом, негативно заряджена молекула ДНК утворює ДНК-ліпідний комплекс – ліпоплекс. Переваги застосування таких комплексів порівняно з вірусними векторами полягають у здатності нести більший об’єм інформації, неможливості виникнення рекомбінацій та появи інфекційних властивостей. Конструкти мають нижчу вірогідність ініціації імунної відповіді або реакції запалення, вони простіші та дешевші у виготовленні. В 2003 р. були створені надзвичайно малі – мілімікронні ліпосоми покриті полімером поліетиленгліколем, які здатні переносити терапевтичну ДНК в нейрони головного мозку і через пори в ядро. До цього перенесення генів в нейрони головного мозку було неможливим із-за того, що вірусні вектори не в стані проходити гематоенцефалічний барєр. На основі створеної технології розроблено методи генної терапії хвороби Паркінсона.

Для доставки до клітин великих генетичних конструкцій (>10 т.п.н.) за участю ендосомного клітинного транспорту утворюють кон’югати ДНК з іншими молекулами. Для цього полі-L-лізин ковалентно зшивають з молекулою, яка є лігандом, здатним зв’язуватись зі специфічним рецептором на поверхні клітини та кон’югують з ДНК. У результаті створюється компактна, щільно скручена структура (тор) на зовнішній поверхні якої розміщуються сайти зв’язування з рецепторами клітин. Такий підхід забезпечує цілеспрямовану доставку генних конструктів лише у клітини, що містять відповідні рецептори.

Полімерні молекули, що несуть надлишковий катіонний заряд, можуть суттєво підвищувати ефективність трансфекції. Певну активність мають навіть невеликі молекули (протамін, диметилсульфоксид, похідні імідазолу, граміцидин, ліпополіамін). Більшу активність проявляють синтетичні полімери (поліетиленімін, полілізин, ліпополілізин або його кон’югати з трансферином, галактозою, манозою), а також природні катіонні протеїни (гістони). Висока ефективність багатих на лізин пептидів та протеїнів може бути зумовлена їх схожістю зі специфічними сигнальними послідовностями, відповідальними за транспорт з цитоплазми у ядро. Водночас полісахариди та протеїнові ліганди, що входять до складу зазначених комплексів, обумовлюють їх комплексоутворення зі специфічними рецепторами на поверхні клітин.

Способи реалізації підходів генної терапії. Для досягнення максимального ефекту, залежно від мети, що ставиться за використання генної терапії, обирається стратегія на основі застосування протеїнів або РНК.

Стратегії на основі протеїнів включають: 1. Введення “суїцидальних” генів. Клітини трансфекують суїцидальним геном з метою їх негативної селекції (видалення). Суїцидальний ген здійснює експресію ензиму, який перетворить певний нетоксичний лікарський засіб на його токсичну форму. Токсичний продукт вбиває трансформовану клітину. Певні успіхи досягнуті у використанні тимідилаткінази вірусу простого герпесу. Цей ген вибірково фосфорилює синтетичний нуклеозидний аналог генцикловір, який потім ефективно пригнічує синтез ДНК та обумовлює загибель пухлинних клітин.  2. Домінант-негативні протеїни. Вводиться ген (або викликається мутація в гені), що експресує мутантну одну з субодиниць олігомерного протеїну. Такий домінант-негативний протеїн взаємодіючи з нормальними субодиницями протеїну утворює функціонально неактивний комплекс. 3. Химерні рецептори ВІЛ. CD4 – модифіковані Т-лімфоцити інгібують реплікацію вірусів у Т-клітинах та макрофагах in vitro а також опосередковують загибель ВІЛ-інфікованих Т-клітин. 4. Внутрішньоклітинні одноланцюгові антитіла (SFv). Такі антитіла приєднуються до вірусних протеїнів в клітині та блокують їх дію, зокрема це анті-Rev SFv та анті-gr120 SFv.

Стратегії на основі РНК включають:

1. РНК-капкани – блокування зворотної транскрипції. Молекули малих РНК містять незамінні цис-взаємодіючі елементи, які зв’язують транс-взаємодіючі протеїни. Тому транс-взаємодіючі протеїни не звязуються з їх справжніми мішенями-послідовностями. При значному рівні експресії їх може бути цілком достатньо для цис-взаємодіючих послідовностей віруса, які є абсолютно необхідними для реплікації віруса.

2. Особливий спосіб дії мають генні конструкції, призначені для пригнічення функціонування генів. Зазвичай їх дію спрямовують на вимкнення функції матричної РНК (мРНК), що кодує протеїн, синтез якого планується загальмувати. Синтезуються штучні антисмислові, одноланцюгові РНК, що володіють комплементарними нуклеотидними послідовностями до мРНК-мішеней. В парі з мРНК-мішенями вони утворюють дволанцюгові структури РНК, які або блокують трансляцію, або стають мішенню для деградації в клітині.

3. Рибозими. Молекули малих РНК носять назву “каталітичні РНК”. Вони розщеплюють РНК-мішені по специфічних послідовностях. Зв'язуюча ділянка молекули рибозиму впізнає специфічний сайт розщеплення. Рибозими можуть розпізнавати критичні сайти-мішені, такі як gag, tat та U5.

Результати клінічних випробувань лікування ВІЛ-інфекції методом генної терапії на 74 добровольцях були опубліковані в 2009 р. В стовбурові клітини ВІЛ-інфікованих вбудовували ген, що кодує синтез “каталітичної РНК” (рибозиму – OZ). Передбачалось, що оснащені рибозимом стовбурові клітини дадуть початок новому поколінню гемопоетичних клітин, які будуть невразливі до ВІЛ-інфекції. “Каталітична РНК” цих клітин буде розщеплювати РНК ВІЛ-вірусу. Протягом 100 тижнів у пацієнтів знижувалось вірусне навантаження та зростало число CD4-лімфоцитів – клітин, основних мішеней вірусу імунодефіциту. Однак з часом число генетично модифікованих клітин у крові пацієнтів зменшувалось (до 7%). Генна терапія не викликала у хворих побічних ефектів.

4. РНК-інтерференція (РНКі). Малі інтерферуючі РНК (міРНК – siRNA) є дволанцюговими РНК послідовностями, що містять приблизно 22 пари основ у довжину, зв’язуються з клітинними РНК по специфічних послідовностях та розщеплюють їх по центрах комплементарних ділянок. Процес протікає в ряд стадій, що включають –  залучення факторів РНК-інтерференції, утворення РНК-індукованого сайленсингового комплексу (RNA-induced silencing complex (RISC), розгортання міРНК та активацію RISC.  Короткі шпилькові РНК (кш-РНК – shRNA) здатні індукувати сайленсінг генів. Протеїн – рибонуклеаза типу ІІІ, що носить назву Dicer розрізає петлю шпильки shRNA з утворенням внутріклітинної sіРНК.         

Найвагоміші результати генної терапії досягнуті в тих випадках, коли захворювання обумовлене дефектом одного гена. За таких умов значно зростає вірогідність  того, що терапевтичний ген прицільно вбудується у те місце на хромосомі, де розташований дефектний ген. Внаслідок цього при подальшій гомологічній рекомбінації введений ген замістить дефектний. Застосування викладених підходів дозволило досягти значних успіхів у лікуванні ряду моногенних захворювань, зокрема гемофілії, міодистрофії Дюшена, муковісцидозу, синдрому вродженого імунодефіциту, пухлинних захворювань і деяких інших. В літературі наводяться дані про розробку експериментальних підходів, проведення доклінічних та клінічних випробувань методів генної терапії у лікуванні майже 30 моногенних хвороб людини.

Значний відсоток серед протоколів генної терапії займають неспадкові захворювання. Генна терапія таких захворювань базується на припущенні, що введений в організм “терапевтичний” ген призводить до синтезу протеїну, який буде мати терапевтичний ефект. Інша можлива схема базується на зміні властивостей трансфіковапних клітин, а саме клітини стають чутливими до дії лікарських препаратів. Запропонований підхід успішно використовується у лікуванні хвороб серцево-судинної системи, зокрема: у лікуванні тромбозів (запобігання тромбоутворенню), для відновлення судинної системи серцевого м’язу після інфаркту міокарда – продукти введених генів індукують процес судиноутворення (гени ангіогенезу), лікування атеросклерозу, артритів та значної кількості інших захворювань. Незважаючи на дуже широкий спектр неспадкових захворювань, лікуванням яких займається генна терапія, все ж до 80% усіх сучасних розробок генної терапії припадають на пухлинні захворювання.

Застосування генної терапії у лікуванні є достатньо складним процесом та включає ряд невирішених проблем. Широке використання вірусних генних конструкцій, як найбільш ефективних та таких, що дають швидкий ефект лікування, приводить до виникнення сильної імунної відповіді, неопластичної трансформації та знижує позитивний ефект генної терапії. Невирішені проблеми інтегрування терапевтичних генів у геном людини роблять необхідним застосування багаторазових повторів процедури. Ідеальними для лікування з використанням генної терапії є моногенні хвороби. На жаль більшість хвороб обумовлені порушеннями роботи кількох генів (полігенні хвороби). Болючою проблемою розвитку генної терапії є надзвичайно великі фінансові витрати на проведення молекулярної діагностики та генної терапії. Тисячі людських генів запатентовані, а більш коректно – заради бізнесу (прибутків) запатентовано тести для більшості людських генів. Отже щоб отримати інформацію про можливість розвитку хвороби у пацієнта, треба викласти чималу суму грошей.

В Україні дослідження в галузі генної терапії проводяться під керівництвом Кордюма В.А. – член-кор. НАН України, академіка АМН України, завідувача відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Зокрема розробляється генна терапія гіперхолестеринемії.   Виділено ген апо-1 (апопротеїну-1) ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ), створена невірусна молекулярна конструкція його транспорту в клітини печінки та підібрані умови ефективної експресії апопротеїну. Спільно з науковцями Ізраілю розробляються підходи генної терапії інсулінозалежного цукрового діабету. Виділено ген інсуліну, створено невірусну молекулярну конструкцію його транспорту в клітини-мішені та підібрано умови ефективної експресії інсуліну.

 

 

Література

 

1.     Биология стволовых клеток и клеточные технологии. // Под ред. М.А.Пальцева. – М.: Медицина (в 2-х томах), 2009. –  Том 1 – 272 с., Том 2 – 456 с.

2.     Великий М.М. Медична біотехнологія: генна терапія // Матеріали конференції “Новітні досягнення біотехнології”, Київ. – 2010. – С. 14-15.

3.     Глазко В.И. Генетически модифицированные организмы: от бактерий до человека. – Киев: Из-во “КВІЦ”, 2002. – 210 с.

4.     Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

5.     Карпов О.В., Демидов С.В., Кир’яченко С.С. Клітинна та генна інженерія. Підручник. – Київ: Фітосоцінцентр, 2010. – 208 с.

6.     Verma I.M., Weitzman M.D. Gene therapy: twenty-first century medicine // Annual Rev. Biochemistry – 2005. – V.74. – P. 711-738.